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Dissertation: Jutta Ninck


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Dissertation: Jutta Ninck

Dissertation / Doktorarbeit / Thesis

German Sport University Cologne
Institute of Cardiology and Sports Medicine, Department of Molecular and Cellular Sports Medicine
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Ninck, Jutta (2011): Experimentelle Untersuchungen zum Einfluss extrakorporaler Stoßwellen auf die Signaltransduktion des porcinen Schultergelenkknorpels

Zusammenfassung:
Zusammenfassung
Zielsetzung:
Gegenstand dieser Studie war die Untersuchung des Einflusses radialer extra-korporaler Stoßwellen auf die Signaltransduktion des hyalinen Gelenkknorpels. Zu diesem Zweck wurden mit der Akt1/PKBα sowie der eNOS zwei Markermoleküle ausgewählt, deren Einfluss auf die Mechanotransduktion bereits in einigen Geweben als erwiesen gilt und in Bezug auf den Gelenkknorpel ebenfalls relevant erscheint.

Material und Methoden:
In Kooperation mit dem Institut für Kardiologie sowie der Expermimentellen Medizin der Universität zu Köln wurde das Tierexperiment in Form eines quasi in vivo Großtiermodells unmittelbar post mortem am Schwein durchgeführt. Nach Arthrotomie des Schultergelenks wurden insgesamt 21 Tiere (14,2 (±1,9) Wochen, 45,2 (±4,7) kg) mittels Stoßwellen unterschiedlicher Parameter am Gelenkknorpel behandelt (Geräte Swiss Dolorclast®, Fa. EMS, Nyon, Schweiz und Piezoson 100 plus, Fa. Wolf, Knittlingen, Deutschland). Es erfolgte eine Einteilung in Gruppen à 2-6 Tiere zur Differenzierung einer direkten bzw. indirekten Behandlung des Gewebes, des Einflusses einer Druckerhöhung von 2,5 auf 4 bar im Sinne einer Auslastung des radialen Stoßwellengerätes, zur Prüfung einer Auswirkung der Gelenkform (konkav/konvex) sowie des Unterschiedes zwischen fokussierter und radialer Stoßwellen. Unmitelbar infolge der Stoßwellenapplikation (Zeitpunkt 0 min) sowie nach weiteren 2, 5, 10, 20 und 40 min wurden Proben entnommen, fixiert und für daran anschließende Färbungen in Paraffin konserviert.

Ergebnisse und Interpretation:
Anhand der H.E.-Färbungen wurde der mikroskopisch beurteilbare Erhalt der Strukturintegrität des Knorpels sichergestellt. Mit Hilfe der beobachteten basalen Aktivierung der pAkt1/PKBα (Thr308) sowie der eNOS (Ser1177) in allen Versuchen, gelang der immunhistochemische Nachweis relevanter Signalmoleküle aus derzeit bekannten Mechanotransduktionswegen. Es zeigte sich ein zonenspezifisches Muster im Hinblick auf die Intensität der Kinasenphosphorylierung in Form einer signifikant stärkeren Anfärbung in den tieferen Knorpelzonen gegenüber den oberflächlicheren Schichten. Dies könnte Ausdruck einer vermehrten Grundaktivität der Kinasen infolge einer nachweislich erhöhten PG-Synthese in den betreffenden Knorpelabschnitten sein (Mow et al. 1984).




Ferner geht aus den Daten hervor, dass die eNOS (Ser1177) – analog zu Studien in anderen Geweben (Fulton et al. 1999; Michell et al. 1999; Hess et al. 2006) – als ein direkt nachgeschaltetes Signalmolekül im Transduktionsweg der pAkt1/PKBα angesehen werden könnte. Ihr Aktivierungsmuster war nahezu identisch zur mutmaßlich vorgeschalteten Kinase. Diese scheint somit in der Lage zu sein, die Expression der eNOS und folglich die Aktivität des NO/cGMP Signalweges zu beeinflussen. Die exakte Bedeutung dieser beobachteten Ausschnitte der Zell-Matrix-Kommunikation bedarf einer ergänzenden Analyse weiterer plausibler Bausteine in den einzelnen Signalkaskaden. So würde beispielsweise der Nachweis einer Induktion der Caspase 9 oder des Wachstumsfaktors NF-κB auf Veränderungen in Bezug auf die DNA-Transkription hindeuten und beispielswiese die Einleitung der Apoptose kennzeichnen (Wong und Carter 2003).
Der angenommene Einfluss der Stoßwelle auf die Signaltransduktion fiel dagegen bzgl. der untersuchten Markermoleküle gering aus. Dies traf sowohl auf die radiale als auch auf die fokussierte Wellenform zu. Erklärungsansätze hierfür wären zum einen ein zu geringer mechanischer Impact der Stoßwelle, um Veränderungen der Signaltransduktion zu bewirken; zum anderen könnte die relativ geringe Fallzahl in den einzelnen Gruppen nicht ausreichend sein, um etwaige Unterschiede zum Vorschein zu bringen. So brachte die mehrfaktorielle Varianzanalyse keinen allgemein gültigen signifikanten Unterschied zwischen den behandelten und unbehandelten Knorpelproben hervor, wohingegen sich im Duncan-Test vereinzelt statistisch relevante Differenzen ergaben, die im Rahmen einer größer angelegten Studie evtl. deutlicher ausfallen könnten.

Fazit:
Die vorliegende Arbeit liefert somit erste Einblicke in die Signaltransduktion des hyalinen Gelenkknorpels und gibt Anlass zu der Vermutung, dass die gelenknahe Applikation von Stoßwellen nicht zu einer Beeinträchtigung der Knorpelstruktur führt.

Abstract
Introduction / Purpose:
This study was meant to analyse the activation of Akt (Thr308) and phosphorylation of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS Ser1177) in porcine shoulder joint cartilage, as well as their regulation by radial extracorporeal shock waves (rESW). Protein kinase Bα/Akt1 and eNOS are signalling molecules which have been identified in mechanotransduction pathways of various biological tissues. Concerning joint cartilage, there is first evidence for its regulation by mechanical loading. The detailed biochemical mechanisms behind these functional adaptations, however, still remain unknown.

Materials and Methods:
In cooperation with the Institutes of Cardiology and the one of Experimental Medicine, University of Cologne, the study was performed as a quasi in vivo animal model. Arthrotomy of 21 porcine shoulder joints (14 ( 2) weeks old, 45 ( 5) kg) was carried out directly after sacrifice. Radial ESW of varying parameters were applied onto the left shoulder joints while the right ones served as control (device Swiss Dolorclast®, EMS, Nyon, Switzerland). The animals were divided into groups of 3-6 pigs each in order to differentiate between a direct and an indirect application of rESW, the pressure applied (2,5 and 4 bar), the shape of the joint surface (convex versus concave) as well as the usage of focused or radial SW. Specimen were harvested at 6 different points in time (0, 2, 5, 10, 20 min), fixated and embedded into paraffin.

Results:
H.E.-stainings verified the structural microscopic integrity of the tissue. Immunohisto-chemistries revealed the basal activation of both, Akt and phospho-eNOS (Ser1177) as well as a zone-specific pattern with the upper radial cartilage layer showing significantly higher staining indices than the remaining ones. However, neither the application of rESW nor the difference in time did cause any alterations in the phosphorylation of the two molecules.

Discussion:
The structural staining pattern might be due to the architecture of the tissue as well as to its particular metabolism. The plane shape of the chondrocytes within the superficial layer, the fewer PGs and the tangential alignment of the collagen fibres predispose this section for tensile loads and shear stresses. The lower cartilage zones, however, consist of chondrocytes with a rounder shape, a higher amount of PGs and a horizontal arrangement of the collagen fibres. They are primarily meant to resist axial compressive loads and to compensate the pressure by a release of water. Thus, it seems consistent to detect zone-specific variations within mechanotransduction pathways in order to meet the different requirements of the respective zones.
The parallels between the immunohistochemical staining pattern of phospho-Akt and phospho-eNOS (Ser1177) support the theory of eNOS (Ser1177) being a downstream target in signalling pathways of the activated Akt.
The missing effect of low energy rESW upon the investigated molecules may derive from a mechanical stimulus being too weak / inadequate to cause any alterations in signalling pathways. Besides, the small sample sizes within the groups may be insufficient in order to reveal potential differences.

Conclusion:
This study provides first insides into the signal transduction of porcine joint cartilage and gives reason to believe that the application of rESW in the vicinity of joints may not lead to adverse effects.



14.12.2017 - 03:16